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談嚴重急性呼吸綜合征相關冠狀病毒基因組研究的新技術——RNA干擾

論文來源:   論文作者:   點擊: 次   時間:2011-10-21

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    [摘要] 最近,嚴重急性呼吸綜合征(SARS)在全世界約30個國家和地區散發或流行,眾多實驗室由此展開了針對SARS病原體的國際聯合攻關。目前,已經確認其病原體是一種新型冠狀病毒(命名為SARS-CoV),而且該病毒的全基因組測序已經完成。采用現代分子病毒學實驗技術對SARS病毒的功能基因組進行深入研究,有重要的理論和實際意義。作為一種嶄新的基因沉默技術,RNA干擾無疑將在SARS病毒基因組研究中發揮重要的作用。論文


  [關鍵詞] 嚴重急性呼吸綜合征 冠狀病毒 基因組 RNA干擾


    A novel approach for studying severe acute respiratory syndrome coronavirus genome——RNA interfer-ence


    [ABSTRACT]  The severe acute respiratory syndrome (SARS) has been spreading in nearly 30 countries and regions world-wide recently. In response to its outbreak, many laboratories worldwide collaborated to identify the causative agent of SARS.
  A new type of coronavirus(named SARS-CoV)has been isolated consequently, and the complete genomic sequences of theSARS-CoV have been published. It is very important, at this stage, to deeply investigate the functional genome of SARS-CoV with modern molecular techniques. As a new gene silencing method at RNA level, the recently established RNA inter-ference will be a useful approach for the studies of SARS-CoV genome.


  [KEY WORDS]  severe acute respiratory syndrome; coronavirus; genome; RNA interference


     ① 嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratorysyndrome,SARS)是由SARS相關冠狀病毒即SARS-CoV[1](亦稱SCV)所致的一種以前從未在人類中發現的新疾病。最新的研究(Nature,2003-05-15,423:240)表明,SARS-CoV的致病符合鑒定某種傳染病病原體時必須遵守的經典原則,即郭霍法則(Koch' s postulates)。隨著SARS病原體[2]的確認及其病毒株全基因組測序的完成,SARS-CoV的致病機制和防治研究顯得尤為緊迫,研究其基因組功能便成為焦點之一。
  RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發現的研究生物體基因表達、調控與功能的一項嶄新技術,它利用了由小干擾RNA(small interfer-ing RNA,siRNA)引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默(silencing)現象,其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解,從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進化的結果,是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應。當病毒在宿主細胞內進行復制、增殖時,病毒RNA可被降解成長19~23 nt、具有5′磷酸和3′羥基及2個nt (dTdT或UU) 3′末端的小RNA片段(即siRNA),從而通過RNAi的作用抑制細胞內病毒的增殖。RNAi被預測將是未來10年間最有可能出重大成果的領域之一,并被美國《科學》雜志(Science)評選為2002年度最重要科技突破的首位。將RNAi技術用于SARS病毒基因組的研究,具有十分重要的理論和實際意義。


  1 已知的SARS病毒基因組與蛋白質組特點


    1.1  SARS病毒基因組特點 冠狀病毒屬于套病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus),是一類球形、有包膜的正鏈RNA病毒,共有10余種,主要引起人和動物的呼吸道和腸道疾病。過去已知的冠狀病毒分為3個組,Ⅰ組和Ⅱ組主要為哺乳動物和人冠狀病毒,Ⅲ組主要為禽類冠狀病毒。其宿主范圍嚴格,細胞培養條件較苛刻,人冠狀病毒的適宜培養溫度為33~35℃。新發現的SARS-CoV不屬于上述3組中的任何一組,是一種新型冠狀病毒。
  SARS-CoV基因組為單正鏈RNA,全長約30kb,具感染性。其基因組結構為:5′-帽狀結構-病毒酶-刺突糖蛋白(S)-包膜蛋白(E)-基質膜蛋白(M)-核衣殼蛋白(N)-3′polyA尾。N蛋白包繞著基因組RNA形成核衣殼,核衣殼外層是含S、M、E蛋白的脂質包膜。M和E蛋白對病毒包膜的形成至關重要,M蛋白還能與N蛋白相互作用,將核衣殼裝配成病毒。S蛋白突出于病毒包膜表面所形成的刺突可特異性地與宿主細胞受體結合,使細胞和病毒發生膜融合。病毒酶基因約占基因組的2/3,包含2個開放閱讀框架(ORF):ORF1a和ORF1b,所編碼的2個聚蛋白經裂解后形成病毒蛋白酶(3CLpro)和RNA依賴的RNA聚合酶(POL)等,這些酶可指導病毒基因組的復制,同時在負鏈合成期間產生嵌套的轉錄本(3′端相同),用于病毒蛋白質的合成。
  SARS-CoV的其他蛋白是從亞基因組mRNAs翻譯來的。亞基因組mRNAs的合成是一個不連續的轉錄過程,亞基因組負鏈在其3′端有一個互補的先導序列可作為亞基因組mRNAs合成的模板。
  SARS-CoV也編碼多個功能未知的非結構蛋白,分別位于S和E之間、M和N之間或者N的下游,這些非結構蛋白對病毒復制不是必需的[3]。過去已知的兩株人冠狀病毒(OC43和229E)需用人胚器官或人胚細胞培養,且均不能在Vero E6細胞中增殖。而SARS-CoV則可感染Vero E6細胞并在其中增殖。
  到目前為止,已報道的SARS-CoV全基因組序列主要有11株。其中美國公布的Urbani株基因組全長29 727 bp,加拿大公布的TOR2株基因組全長29 751 bp,中國香港公布 論文學術論文網整理提供

的CUHK株基因組全長29 736 bp,HKU株基因組全長29 742 bp,中國北京公布的BJ01株基因組全長29 725 bp。將該5株SARS-CoV基因序列進行比較后發現:中國北京的BJ01株與香港的CUHK株最接近,香港的HKU株與加拿大的TOR2株較為接近,美國的Urbani株則與其他各株距離較遠。
  SARS-CoV(Urbani株)G+C含量為41%(已知的冠狀病毒G+C含量為37%~42%),基因組有11個ORF,其中5個ORFs編碼的非結構蛋白氨基酸殘基數在50個以上,它們分布在結構基因中。基因組中的AAACGAAC序列可能是轉錄調節序列(TRS)的核心,它常在ORF1a、S、E、M、N等開放閱讀框架上游出現。如以加拿大公布的TOR2株SARS-CoV基因組為原型,對11株SARS-CoV全基因組進行突變分析發現,共有42個點突變和2個缺失突變,其中有9個點突變在兩個以上的基因組中出現,其余的只在單個基因組中出現[4]。因此,SARS-Cov基因組的變異性并不大。
  1.2  SARS-CoV蛋白質組特點 SARS-CoV基因組至少編碼11種蛋白質,對其中6種主要蛋白產物(3CLpro、POL、S、E、M、N)進行的種系發生分析表明,SARS-CoV與已知的3組冠狀病毒均不同,說明SARS-CoV是一種新型冠狀病毒。3CLpro是SARS-CoV編碼的一個主要病毒蛋白酶,能催化組氨酸和半胱氨酸殘基(His3281和Cys3385)的水解,對于SARS-CoV復制具有控制作用。3CLpro基因在所有冠狀病毒中是比較保守的,最新的蛋白酶同源模建研究[5]認為,該蛋白將是研發抗SARS-CoV藥物的很有希望的作用靶點。刺突蛋白(S蛋白)為大的Ⅰ型膜糖蛋白,蛋白質介導的膜融合學說認為,冠狀病毒S蛋白羧基端的α兩性區域(親水、親脂)成卷曲螺旋,可將融合肽引向跨膜結構域,從而使細胞和病毒發生膜融合。因此,S蛋白主要負責與宿主細胞上的受體結合并參與膜融合,對于病毒包膜的形成具有重要作用。而且,該蛋白含有重要的病毒中和表位,其氨基酸殘基的改變能顯著影響病毒的毒力和病毒對宿主細胞的親嗜性。某些冠狀病毒的S蛋白可裂解成S1和S2亞單位,但SARS-CoV的S蛋白由于缺少堿性氨基酸殘基的裂解部位,因而不裂解成S1和S2亞單位。此外,SARS-CoV S蛋白的氨基酸序列與其他類型的冠狀病毒S蛋白之間同源性低(為20%~27%),故難以預測其結合的受體或SARS-CoV的抗原性。SARS-CoV的冠狀病毒膜糖蛋白(M蛋白)定位在細胞內膜結構上,其N末端結構域暴露在病毒表面而C末端位于病毒膜內。M蛋白、E蛋白和核衣殼之間相互作用,使病毒穿膜出芽。
  SARS-CoV的N蛋白N末端存在保守的FYYL-GTGP序列,推測SARS-CoV的N蛋白是含422個氨基酸殘基的堿性蛋白,其中部有7個連續疏水性殘基。在SARS-CoV裝配期間,N蛋白與病毒RNA的包裝信號結合,引導形成螺旋狀核衣殼。因此,除編碼病毒酶蛋白之外,SARS-CoV的S蛋白、M蛋白、E蛋白及N蛋白在病毒復制、裝配以及與宿主細胞的結合乃至侵入過程中均起著重要作用。


  2 RNAi用于SARS病毒基因功能研究


    2.1  RNAi作用于SARS-CoV基因復制與表達的機制 作為一種嶄新、高效的RNA水平上的基因操作技術,RNAi在植物、動物、細菌及病毒的功能基因組研究中具有十分重要的意義。RNAi技術不像傳統方法那樣改變基因組結構即可進行特定基因·功能檢測,從而體現其快捷、高效的特點。Wo-jtkowiak等[6]采用該技術研究了在不同時間點特定基因表達受阻對植物發育的影響。Means等[7]通過RNAi證實了桿狀病毒(OpMNPV)感染時Op-IAP3蛋白具有抗凋亡作用。Rubinson等[8]將發夾狀RNAs(shRNAs)高效轉入哺乳動物細胞、干細胞及其分化的不同子代細胞后發現,轉染細胞及動物子代體內目的基因的表達均被有效抑制。Shlomai等[9]通過實驗發現, RNAi可抑制HBV病毒的復制。此外,RNAi在對鼠皰疹病毒[10]、人免疫缺陷病毒(HIV)[11~13]、丙型肝炎病毒(HCV)[14,15]、人乳頭瘤病毒(HPV)[16]和桿狀病毒[17]的研究中也有應用并取得了較好的結果。
  作為一種RNA病毒,SARS-CoV是RNAi研究的理想材料:外源的SARS-CoV RNA分子在細胞內形成dsRNA后,與RNaseⅢ核酸酶家族中的DICER結合并使之激活,激活的DICER能將特定的SARS-CoV dsRNA切割成長19~23 nt的siR-NA(圖1)。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈,繼之由反義siRNA參與形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencingcomplex, RISC)。RISC為一引導并切割特異SARS-CoV RNA的特殊結構,其中含反義siRNA、核酸內切酶、核酸外切酶和解旋酶等。siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA,而且可作為引物與靶RNA結合,在RdRP的催化下合成新的dsRNA。新合成的dsRNA再由DICER切割產生大量的次級siRNA,從而使RNAi的作用進一步放大,最終將靶mRNA完全降解[18~20]。


  Fig 1 Mechanism of RNA interference for SARS-CoV

    2.2  RNAi用于SARS病毒基因研究 如何將RNAi技術用于SARS病毒基因組的研究?首先,分別針對SARS-CoV基因組[21]M區、E區、N區、S區、3CL區或POL區,通過計算機軟件設計出數十條siRNA(每條的長度為19~21 nt,3′末端為tt,G/C含量為40%~60%)。利用BLAST軟件,分析并選出與宿主基因無同源性、而在各株SARS-CoV中較為保守的片段。然后,采用載體體外轉錄合成相應的siRNA,主要合成步驟如下:(1)對于每條siRNA,均先合成2條29~31 mer的DNA片段,其中的8 nt與T7啟動子引物的5′端互補;(2)DNA片段分別與T7啟動子引物退火,用Klenow DNA多聚酶將其互補成正、反義dsDNA;(3)分別用T7RNA多聚酶催化合成正、反義單鏈RNA;(4)將正、反義單鏈RNA混合、雜交,形成dsRNA;(5)去除DNA模板和dsRNA兩端的單鏈RNA,經柱純化后即為可用于RNAi研究的siRNA。此外,也可采用轉錄載體體內表達法在體內誘導產生siRNA:將設計好的siRNA所對應的DNA片段定向插入特殊的轉錄載 本論文由學術論文網整理提供


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